ИФА-ЗН-антиген

Описание

Набор реагентов ИФА-ЗН-антиген: Тест-система иммуноферментная для выявления антигена вируса лихорадки Западного Нила 48 определений

ИНСТРУКЦИЯ

по применению набора реагентов «ИФА-ЗН-антиген»

Тест-система иммуноферментная для выявления антигена вируса лихорадки Западного Нила

 НАЗНАЧЕНИЕ

Выявление антигена вируса лихорадки Западного Нила (ЗН) в полевых и клинических материалах: комарах, спинно-мозговой жидкости (СМЖ) и в тканях органов погибших людей.

СОСТАВ НАБОРА

Иммуносорбент – мышиные антитела класса G к вирусу ЗН (IgGЗН) и нормальный  мышиный иммуноглобулин класса G (IgGN), сорбированные на поверхности лунок 96-луночного разборного полистиролового плоскодонного планшета. IgGЗН сорбированы в нечетных рядах лунок,  IgGN – в четных рядах                                                             2 шт.

К+ – контрольный  положительный образец – антиген вируса ЗН, инактивированный 0,004% бетапропиолактоном; прозрачная бесцветная или светло-желтого цвета жидкость                                                                                                                             1 флакон (0,1 мл).

К – контрольный  отрицательный образец – нормальный антиген, приготовленный из ткани мозга неинфицированных мышей; инактивированный 0,004% бетапропиолактоном; прозрачная бесцветная или светло-желтого цвета жидкость                                                                                                                                                                           1 флакон (0,1 мл).

Коньюгат – антитела к вирусу ЗН из асцитной жидкости мышей, инфицированных вирусом ЗН, меченые пероксидазой хрена; прозрачная бесцветная или светло-желтого цвета жидкость                                                                                                   1 флакон (0,5 мл).

РБР(х10) – 10-кратный концентрат раствора для разведения образцов – концентрат раствора для разведения исследуемых образцов, антигенов, конъюгата; прозрачная красного цвета жидкость                                                                                                1 флакон (10 мл).

ФСБ-Т(х25) – 25-кратный концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином – концентрат раствора для промывания планшетов; слегка опалесцирующая бесцветная пенящаяся жидкость, возможно выпадение осадка солей белого цвета, растворяющегося при температуре 37оС в течение 30 мин                                                          1 флакон (80 мл).

ТМБ – хромоген – 0,25 % раствор 3,3′,5,5′-тетраметилбензидина; прозрачная бесцветная жидкость                                                                                1 флакон (1,5 мл).

ЦР – цитратный раствор – раствор для приготовления рабочего раствора хромогена; прозрачная бесцветная жидкость                                                                        2 флакона (по 12 мл).

Стоп-реагент – серная кислота в концентрации 0,5 моль/л; прозрачная бесцветная жидкость                                                                                                            1 флакон (25 мл).

ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ

При наличии в исследуемом образце антигена вируса ЗН, антиген связывается с антителами класса G к вирусу ЗН, сорбированными в лунках планшета. Образующийся при этом комплекс (антитело-антиген) связывается затем с конъюгатом – мышиными антителами к вирусу ЗН, меченными пероксидазой хрена, и выявляется в реакции с индикаторным раствором, содержащим хромоген – тетраметилбензидин, в результате которой меняется цвет (оптическая плотность) реакционной смеси в лунке планшета; изменение регистрируется спектрофотометрически.

АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА

Набор рассчитан на проведение 96 определений, включая контрольные.

Предусмотрено дробное использование набора.

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

Набор «ИФА-ЗН–антиген» является биологически безопасным, т.к антиген вируса ЗН полностью инактивирован. Однако при обследовании полевых и клинических материалов необходимо соблюдать меры предосторожности и обращаться с ними как с материалами, потенциально инфицированными вирусом, в соответствии с требованиями СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I — II групп патогенности (опасности)».

  • Работать в резиновых (латексных) перчатках.
  • Не пипетировать ртом.

Утилизацию или уничтожение, дезинфекцию наборов реагентов следует проводить в соответствии с СанПин 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами» и МУ-287-113 «Методические указания по дезинфекции, предстерилизационной очистке и стерилизации изделий медицинского назначения».

СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ

Нельзя использовать реагенты из наборов разных серий или смешивать их в процессе приготовления растворов, а также использовать реагенты по истечении срока годности. Перед использованием все реагенты набора необходимо выдержать 30 мин при       температуре от 18 до 25 оС.

Достоверность результатов зависит от строгого выполнения следующих правил:

  • Для приготовления растворов и проведения ИФА следует использовать чистую мерную посуду и автоматические пипетки с погрешностью измерения объемов не более 5%.
  • Сразу после постановки реакции плотно закрытые флаконы с исходными реагентами необходимо поместить в холодильник (при температуре от 2 до 8 оС), использовать в течение 1 мес.
  • Растворы хромогена и конъюгата в рабочем разведении готовить непосредственно перед использованием. Исключить воздействие света на раствор хромогена.
  • При промывке планшета лунки заполнять полностью (370 мкл промывочного раствора) и не касаться лунок наконечниками пипетки.
  • Не допускать высыхания лунок планшета между отдельными операциями.
  • Наконечники для пипеток, используемые для работы с исследуемыми сыворотками и контрольными образцами использовать однократно.
  • Для отбора исследуемых образцов и реагентов тест-системы использовать автоматические пипетки с погрешностью измерения объёмов не более 5%.
Оборудование и материалы

– Дозаторы (пипетки полуавтоматические одно– и многоканальные переменного объема) для внесения реагентов в лунки планшета с погрешностью дозирования не более
5 %.

– Автоматические промыватели или восьми– и  двенадцатиканальные пипеточные дозаторы для промывания лунок планшета.

– Термостат на 37 оС.

– Спектрофотометр.

– Перчатки резиновые или латексные.

– Вода очищенная (дистиллированная или деионизированная).

 

Анализируемые образцы

Реакцию проводят с надосадочной жидкостью суспензий гомогенатов комаров, тканей органов погибших людей, а также со спинно-мозговой жидкостью (СМЖ) больных людей.

Подготовка исследуемых образцов

Приготовление суспензии комаров

Поступивших комаров (20 особей) промывают однократно 70% раствором спирта, затем 0,9% раствором хлорида натрия с антибиотиками (1000 ед. пенициллина и 500 мг стрептомицина на 1 мл среды), раскладывают в пластиковые пробирки, типа Эппендорф, по 1 экземпляру, маркируют и погружают в жидкий азот до обследования.

Перед обследованием готовят суспензию, растирая замороженных комаров пестиком, добавляют на каждого комара по 0,2 мл раствора для разведения образцов (РБР).

Напитавшихся комаров растирают в фарфоровых ступках пестиком и добавляют небольшое количество стеклянного песка.

Суспензии комаров центрифугируют 5 мин при 2 тыс. об/мин.

В ИФА обследуют надосадочную жидкость.

Приготовление суспензий из тканей органов погибших людей

Для исследования тканей органов погибших людей необходимо приготовить 1% суспензию на РБР.  Суспензию центрифугируют при 3000-6000 об/мин в течение 20-30 мин, надосадочную жидкость переносят в стерильную пробирку, маркируют и исследуют немедленно.

Приготовление рабочего разведения спинно-мозговой жидкости (СМЖ)

СМЖ развести РБР в соотношении 1:10.

Пробы, подготовленные для ИФА, в случае необходимости, можно хранить в замороженном состоянии при температуре не выше минус 20 оС.

Подготовка рабочих растворов и реагентов для ИФА

Все реагенты до начала анализа выдержать 30 мин при температуре от 18 до 25 оС

Приготовление рабочего промывающего  раствора (ФСБ-Т)

ФСБ-Т(х25) интенсивно перемешать (в случае выпадения осадка – прогреть при температуре 37 оС в течение 30 мин до полного растворения солей), развести водой очищенной в соотношении 1:25. В зависимости от числа используемых стрипов, отобрать необходимое количество концентрата и довести водой очищенной до объёма, указанного в табл. 1.

 

 

 

Таблица 1

Реагент Объем реагента (мл) на…стрипов
2 4 6 8 10 12
ФСБ-Т(х25) 7 13 20 27 33 40
Вода очищенная до 175 до 325 до 500 до 657 до 825 до 1000

 

 

Приготовление рабочего  разводящего буферного раствора (РБР)

РБР(х10) развести в 10 раз  водой очищенной (1,0 мл концентрата на 9,0 мл воды).

Раствор хранить при температуре от 2 до 8 оС не более 1 сут.

Приготовление рабочего разведения конъюгата

Готовить не более чем за 10 мин до использования!

При постановке на целом планшете к 12 мл РБР добавить 240 мкл конъюгата; тщательно перемешать.

При использовании меньшего количества стрипов необходимый объем РБР перенести в чистую емкость (желательно одноразовую) и добавить конъюгат в количестве, указанном в табл. 2.

Таблица 2

Реагент Объем реагента на…стрипов
2 4 6 8 10 12
РБР, мл 2,0 4,0 6,0 8,0 10 12
Коньюгат, мкл 40 80 120 160 200 240

Раствор хранить при температуре от 2 до 8 оС не более 1 ч.

Приготовление субстратно-индикаторного раствора

Готовить непосредственно перед использованием в защищенном от прямого солнечного света месте.

При исследовании на целом планшете во флакон с ЦР добавить 600 мл ТМБ.

При постановке на меньшем числе стрипов необходимый объем ЦР перенести в чистую (желательно одноразовую) емкость и добавить ТМБ в количестве, указанном в табл. 4.

Таблица 4

Реагент Объем реагента на…стрипов
2 4 6 8 10 12
ЦР, мл 2,0 4,0 6,0 8,0 10 12
ТМБ, мкл 100 200 300 400 500 600

Раствор хранению не подлежит.

Иммуносорбент, К+, К, стоп-реагент готовы к использованию.

 

Проведение ИФА

Извлечь из пакета планшет или необходимое количество стрипов. Оставшиеся стрипы хранить в плотно закрытом пакете не более 1 мес при температуре от 2 до 8 оС.

Лунки А1 и А2 оставить пустыми для измерения уровня «бланк» (оптический нуль фотометра), в остальные внести по 90 мкл РБР.

В лунки B1, В2 внести по 10 мкл К+, в лунки С1, С2 – по 10 мкл К, в остальные лунки, кроме А1 и А2, внести по 100 мкл исследуемых образцов. Каждый образец вносить в 2 лунки (1 лунка – в четном ряду (IgGN), 1 лунка – в нечетном (IgGЗН)). Содержимое лунок перемешивать пипетированием при внесении образцов.

Планшет заклеить пленкой или закрыть крышкой и инкубировать 60 мин в термостате при температуре 37 оС.

С помощью промывающего устройства удалить содержимое лунок в контейнер с дезраствором. В каждую лунку внести ФСБ-Т, заполняя ее до краев (следует вносить не менее 370 мкл раствора), процедуру промывки выполняют 3 раза. По окончании промывки удаляют влагу из лунок, постукивая планшетом по фильтровальной бумаге, положенной на полиэтиленовую пленку.

Во все лунки планшета, кроме лунок А1 и А2, внести по 100 мкл рабочего разведения конъюгата. Планшет закрыть крышкой и выдержать при температуре 37 оС в течение 60 мин.

6 раз промыть планшет, как указано выше.

В каждую лунку планшета внести по 100 мкл свежеприготовленного субстратно-индикаторного раствора. Планшет поместить в защищенное от света место при комнатной температуре на 10 мин.

В каждую лунку внести по 100 мкл стоп-реагента и сразу же учесть результаты реакции.

Регистрация и учет результатов

Результаты ИФА регистрировать спектрофотометрически немедленно после остановки реакции, измеряя оптическую плотность (ОП) при длине волны 450 нм. В качестве уровня «бланк» используют ОП содержимого лунки А1.

Результаты ИФА учитываются при следующих условиях:

ОП в лунке А2 – не более 0,2;

ОП К+ в лунке с IgGЗН – не менее 0,6;

ОП К+ в лунке с IgGN – не более 0,2;

ОП К в лунках с IgGЗН и с IgGN – не более 0,2.

В противном случае исследование необходимо повторить.

Исследуемые образцы считаются положительными, т.е. содержат антиген вируса ЗН, если ОП в лунке с IgGЗН составляет не менее 0,3, а ОП в лунке с IgGN – не более 0,2.

Исследуемые образцы считаются отрицательными, т.е. не содержат антигена вируса ЗН, если ОП в лунке с IgGЗН и в лунке с IgGN составляет не более 0,2.

В случае необходимости определения титра антигена вируса ЗН готовится ряд двукратных разведений образца в РБР, каждое разведение исследуется, как указано выше. Титром антигена вируса ЗН считается максимальное разведение, в котором получены положительные результаты.

СРОК ГОДНОСТИ

Срок годности набора – 6 мес. Набор с истекшим сроком годности применению не подлежит.

ХРАНЕНИЕ И ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ

Хранение — в упаковке предприятия-изготовителя в соответствии с СП 3.3.2.1248-03 при температуре от 2 до 8 оС. Замораживание не допускается.

Транспортирование — в соответствии с СП 3.3.2.1248-03 при температуре от 2 до
оС. Замораживание не допускается. Допускается транспортирование при температуре от 9 до 25 оС в течение 72 ч. На дальние расстояния — только авиатранспортом.

Скачать Инструкцию 

Скачать РУ

Скачать МУК 



Рекомендуемые Товары