ИФА-ВПГ IgG

ИФА-ВПГ IgG № ФСР 2011/11263 от 07.07.2011
Тест-система иммуноферментная для выявления антител класса G к вирусу простого герпеса 1 типа

И Н С Т Р У К Ц И Я

по применению набора реагентов

“ИФА-ВПГ-2-IgG”

Тест-система иммуноферментная для выявления

иммуноглобулинов класса G к вирусу простого герпеса II типа

Регистрационное удостоверение №ФСР 2009/06108 от “25”ноября 2009 г.

НАЗНАЧЕНИЕ

Выявление и определение титра видоспецифических иммуноглобулинов класса G к вирусу простого герпеса II типа (ВПГ-2) в сыворотке (плазме) крови человека методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) на твердофазном носителе при “ручной” постановке и с использованием ИФА-анализаторов.

СОСТАВ И КОМПЛЕКТАЦИЯ НАБОРА

Иммуносорбент	лизатный инактивированный очищенный антиген вируса простого герпеса II типа (ВПГ-2), сорбированный на 96-луночном разборном полистироловом планшете для иммунологических реакций с плоским дном (используются “ломающиеся” стрипы)	1 планшет
Иммуносорбент	допускается раздельная упаковка стрипов (по 1-4 стрипа в пакете)
Контрольный положительный образец (К⁺)	инактивированный; содержит антитела класса G к ВПГ-2 в титре 1:500; прозрачная красного цвета жидкость	1 фл. (1,2 мл)
Контрольный образец уровня “среза” (К⁺_пор)	инактивированный; содержит антитела класса G к ВПГ-2 в “пороговом” титре (1:100); прозрачная желтого цвета жидкость	1 фл. (1,2 мл)
Контрольный отрицательный образец (К^–)	инактивированный; прозрачная зеленого цвета жидкость	1 фл. (1,2 мл)
Конъюгат	антитела моноклональные мышиные против иммуноглобулинов человека класса G, меченые пероксидазой хрена; прозрачная розового цвета жидкость	1 фл. (13 мл)
Раствор индикаторный (РИ)	стабилизированный раствор тетраметилбензидина; прозрачная бесцветная или светло-желтая жидкость	1 фл. (13 мл)
25-кратный концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином [ФСБ-Т(х25)]	прозрачная или слегка опалесцирующая пенящаяся бесцветная жидкость; возможно выпадение осадка солей белого цвета, растворяющегося при температуре 37 ⁰С в течение 30 мин	1 фл. (80 мл) или 2 фл. (по 40 мл)
Раствор для разведения образцов (РРО)	прозрачная жидкость синего цвета	1 фл. (15 мл)
Раствор для предварительного разведения образцов (РПРО)	прозрачная жидкость розового цвета	1 фл. (по 15 мл)
Стоп-реагент	прозрачная бесцветная жидкость	1 фл. (12,5 мл)

Примечания. 1. Набор включает все реагенты, необходимые для постановки ИФА, кроме очищенной (дистиллированной или деионизированной) воды.

ФСБ-Т(х25), РИ,РРО,РПРО, стоп-реагент – унифицированы для всех наборов ЗАО “ЭКОлаб”, в которых используются указанные реагенты.

Набор может быть дополнительно укомплектован:

вспомогательным планшетом для разведения образцов (1 шт.),

вспомогательными пластиковыми емкостями (4 шт.),

одноразовыми наконечниками для автоматических пипеток (16 шт.)

клейкой пленкой для планшетов (4 шт.).

Компоненты набора упакованы в коробку, в коробку вложена инструкция по применению и бланк калибровочного графика.

По желанию потребителя базовая комплектация набора (число индивидуальных упаковок с реагентами и их объемы) может быть изменена.

ОСНОВНЫЕ ПОТРЕБИТЕЛЬСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Базовый вариант комплектации набора позволяет одномоментное исследование 96 образцов, включая контрольные (на контрольные образцы используется 6 лунок, одна лунка – для выведения уровня “бланк”). Предусмотрена возможность проведения раздельных исследований с использованием необходимого количества стрипов:

Число стрипов	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
Число иссл. обр.	1	2-9	10-17	18-25	26-33	34-41	42-49	50-57	58-65	66-73	74-81	82-89

ПРИНЦИП МЕТОДА

При наличии в исследуемом образце иммуноглобулинов класса G к ВПГ-2 они во время первой инкубации связываются с антигеном ВПГ-2, сорбированным на поверхности лунок полистиролового планшета. Этот комплекс во время второй инкубации связывается с конъюгатом – антителами против IgG человека, меченными пероксидазой хрена. Далее, после добавления индикаторного раствора (хромоген – тетраметилбензидин) в результате ферментативной реакции реакционная смесь в лунках планшета окрашивается пропорционально концентрации антител класса G к ВПГ-2. Реакция останавливается добавлением стоп-реагента. Интенсивность окрашивания (оптическая плотность) регистрируется с помощью спектрофотометра.

АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА

Диагностическая чувствительность и диагностическая специфичность при проверке на сыворотках стандартизованной панели предприятия или аналогичных коммерческих панелей, разрешенных к применению в РФ – 100 %.

ИССЛЕДУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ

Сыворотка (плазма) крови человека объемом не менее 10 мкл.

Образцы до исследования можно хранить не более 7 сут при температуре от 2 до 8 ^оС или до 3 мес при температуре минус 20 ^оС или более низкой. Допускается только однократное замораживание-размораживание образцов. Размороженные образцы перед исследованием тщательно перемешать.

Не допускается использование для исследования образцов с повышенным содержанием липидов и (или) с признаками гемолиза, и (или) с видимым микробным проростом.

Образцы, содержащие осадок, перед анализом отцентрифугировать в течение 10-15 мин при 2500-3000 об/мин.

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

Набор биологически безопасен, однако образцы сывороток крови человека следует рассматривать как потенциально инфицированные.

Стоп-реагент при попадании на незащищенную кожу и слизистые может вызывать химические ожоги. В случае попадания на кожу – немедленно промойте пораженный участок водой.

СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ

Оборудование и материалы (для “ручной” постановки)

Дозаторы пипеточные (пипетки полуавтоматические одно- и многоканальные переменного объема) для внесения реагентов в лунки планшета с погрешностью дозирования не более 5 % с наконечниками полипропиленовыми одноразовыми.

Ручные, или автоматические промыватели, или восьми- и двенадцатиканальные пипеточные дозаторы для промывания лунок планшета.

Спектрофотометр вертикального сканирования для измерения оптической плотности в лунках планшета при 450 нм и/или в двухволновом режиме при основной длине волны 450 нм и длине волны сравнения в диапазоне 620-650 нм.

Центрифуга лабораторная на 2,5-3,0 тыс. об/мин, термостат на 37 ^оС, холодильник бытовой, фильтровальная бумага.

Вода очищенная (дистиллированная или деионизированная).

70 %-ный раствор спирта этилового и 6 %-ный раствор перекиси водорода (дез.растворы) или растворы иных дезинфектантов, разрешенных к применению СП 1.32322-08, кроме хлорсодержащих.

Приготовление рабочих растворов реагентов для ИФА

Перед работой извлечь набор из холодильника, вскрыть упаковку и выдержать все реагенты перед проведением анализа не менее 30 мин при температуре от 18 до 25 ^оС.

Предварительное разведение исследуемых образцов

Исследуемые образцы развести 1:10 во вспомогательном планшете. Для этого внести в его лунки по 90 мкл РПРО и добавить по 10 мкл сыворотки, тщательно перемешать пипетированием. При этом розовый цвет должен измениться на желтый. Если изменение цвета не произошло, данный образец необходимо исследовать повторно с целью исключения неправильных результатов. Рабочее разведение (1:100) готовить непосредственно в лунках иммуносорбента (см. раздел Проведение ИФА (“ручная” постановка), п. 2).

Рабочие разведения образцов хранить не более 6 ч при температуре от 18 до 25 ^оС.

Приготовление рабочего промывочного раствора (ФСБ-Т)

При выпадении осадка солей в ФСБ-Т(х25) прогреть его при температуре 37 ^оС до полного растворения осадка.

При постановках с использованием ИФА-анализаторов 80 мл ФСБ-Т(х25) довести водой очищенной до 2 л.

При дробной “ручной” постановке использовать соотношения объемов ФСБ-Т(х25) и воды, указанные в табл. 1 для разного числа используемых стрипов.

Таблица 1

Число стрипов	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
ФСБ-Т(х25), мл	7	10	13	17	20	23	27	30	33	37	40
Вода очищенная, мл	до 175	до 250	до 325	до 425	до 500	до 575	до 675	до 750	до 825	до 925	до 1000

Готовый рабочий промывочный раствор хранить при температуре от 2 до 8 ºС не более 14 сут.

Приготовление остальных реагентов

К^–, К⁺, К⁺_пор, конъюгат, РИ,РРО,РПРО, и стоп-реагент готовы к применению.

После вскрытия упаковок неиспользованные реагенты допускается хранить в плотно закрытых упаковках при температуре от 2 до 8 ^оС до истечения срока годности.

Проведение ИФА (“ручная” постановка)

Внимание! Соблюдение указанных ниже температуры и времени инкубации планшетов на каждой стадии постановки крайне важно для получения достоверных результатов.

Извлечь из упаковки рамку планшета и необходимое число стрипов. Неиспользованные стрипы допускается хранить в плотно закрытом пакете с влагопоглотителем при температуре от 2 до 8 ^оС до истечения срока годности.
В лунку А1 внести 100 мкл РРО, в следующие лунки внести по 100 мкл контрольных образцов (по 2 лунки на образец), оставшиеся лунки использовать для исследуемых образцов (по 1 лунке на образец), для чего внести в них: вначале по 90 мкл РРО, а затем – по 10 мкл образцов, предварительно разведенных 1:10 в лунках вспомогательного планшета (см. раздел «Предварительное разведение исследуемых образцов»), тщательно перемешать пипетированием.
Планшет закрыть крышкой или клейкой пленкой. Инкубировать планшет 30 минут при температуре от 21 до 25⁰С в защищенном от света месте.
С помощью промывателя удалить содержимое лунок, 4 раза промыть планшет промывочным раствором, внося в лунки 350-370 мкл раствора. При наличии промывателя, позволяющего производить промывку в режиме “Overflow”, использовать именно этот режим. По окончании промывки остатки раствора удалить из лунок, постукивая перевернутым планшетом по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге.
Во все лунки внести по 100 мкл конъюгата
Планшет закрыть крышкой или клейкой пленкой., инкубировать 30 минут при температуре от 21 до 25⁰С в защищенном от света месте.
С помощью промывателя удалить содержимое лунок, 4 раза промыть планшет как указано в п. 4.
Во все лунки внести по 100 мкл раствора индикаторного, немедленно поместить планшет в защищенное от света место и инкубировать 10–15 минут при температуре от 21 до 25⁰С.
Внести во все лунки в той же последовательности, как и раствор индикаторный, по 100 мкл стоп-реагента, осторожно (постукиванием по планшету) перемешать содержимое лунок и не более чем через 10 мин приступить к учету результатов.

Регистрация и учет результатов качественного исследования

Результаты ИФА регистрировать спектрофотометрически, выводя спектрофотометр на нулевой уровень (“бланк”) по лунке А1 и измеряя оптическую плотность (ОП) при двух длинах волн – 450 нм и 620-650 нм. При отсутствии референс-фильтра на 620-650 нм оптическую плотность (ОП) измерять при длине волны 450 нм.

Результаты ИФА учитывать при следующих условиях:

среднее значение ОП_К+ – не менее 0,60;

среднее значение ОП_К+пор – не менее 0,20;

отношение среднего значения ОП_К+ к среднему значению ОП_К+пор – не менее 1,5;

среднее значение ОП_К– – не более 0,10.

В противном случае исследование необходимо повторить.

Полученные результаты считать:

положительными, если ОП_{образца} больше 1,1×ОП_К+пор ;
отрицательными, если ОП_{образца} меньше 0,9×ОП_К+пор ;
сомнительными, если ОП_{образца} = (1+0,1)×ОП_К+пор.

При получении сомнительных результатов сыворотки рекомендуется исследовать повторно в двух лунках тест-системы. Если результаты опять попадут в пределы сомнительных, следует провести тестирование сывороток, отобранных через 2-4 недели. Если и в данном случае результаты попадут в пределы сомнительных, образцы сывороток считать отрицательными.

Определение титра антител

Для определения титра антител класса G к ВПГ-2 на стандартном бланке (входит в состав набора) строится калибровочный график. Для этого по оси абцисс (логарифмическая шкала) откладываются значения титров К⁺ (1:500) и К⁺_пор (1:100), а по оси ординат (пропорциональная шкала) – соответствующие им средние значения ОП, полученные в ИФА. Полученные точки соединяются прямой линией. Титр антител в исследуемом образцах определяется по калибровочному графику как абсцисса точки, ордината которой равна полученному в ИФА значению ОП.

Если ОП_{образца} превышает ОП_К+, для более точного определения титра рекомендуется при повторном анализе развести данный образец дополнительно. Повторить анализ и полученное по графику значение титра увеличить соответственно дополнительному разведению.

ПОСТАНОВКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИФА-АНАЛИЗАТОРОВ

Подготовить прибор в соответствии с инструкцией по его эксплуатации, ввести программу анализа, соответствующую используемому набору, и провести анализ.

СРОК ГОДНОСТИ

Срок годности набора – 1 год. Набор с истекшим сроком годности применению не подлежит.

ХРАНЕНИЕ И ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ

Хранение

В упаковке предприятия-изготовителя при температуре от 2^оС до 8^оС. Замораживание не допускается.

Транспортирование

При температуре от 2 ^оС до 8 ^оС. Замораживание не допускается. Допускается транспортирование при температуре от 9^оС до 25 ^оС в течение 10 сут.

УСЛОВИЯ ОТПУСКА

Для учреждений здравоохранения.

По вопросам, касающимся качества набора, следует обращаться по адресу 142530, Московская обл., г. Электрогорск, ул. Буденного,a д.1, ЗАО «ЭКОлаб» тел: (49643)3-1374, 3-2311, факс 3-3143, и в учреждение, уполномоченное на проведение Государственного контроля указанной продукции.

КРАТКАЯ СХЕМА ИФА

(ИФА-ВПГ-2-IgG)

Использовать только после тщательного ознакомления с инструкцией!

Внести	в лунку А1– 100 мкл РРО, в лунки B1, С1-. по 100 мкл К⁺, в лунки D1, E1-по 100 мкл К⁺_пор в лунки F1,G1 –по 100 мкл К-, в остальные лунки – вначале по 90 мкл РРО, а затем – по 10 мкл образцов, предварительно разведенных 1:10 в лунках вспомогательного планшета (см. раздел «Предварительное разведение исследуемых образцов»)
Инкубация	30 мин, 21-25 ^оС
Промыть	4 раза промывочным раствором
Внести	по 100 мкл конъюгата в каждую лунку
Инкубация	30 мин, 21-25 ^оС
Промыть	4 раза промывочным раствором
Внести	по 100 мкл индикаторного раствора в каждую лунку
Инкубация	10-15 мин, 21-25 ^оС
Внести	по 100 мкл стоп-реагента в каждую лунку
Измерить	ОП при 450 нм (референс 620-650 нм), «бланк» – по лунке А1

Скачать Инструкцию

Скачать РУ

ИФА-ВПГ IgG