И Н С Т Р У К Ц И Я по применению набора реагентов «ИФА-Краснуха-IgM» Тест-система иммуноферментная для выявления антител класса M к вирусу краснухи
Регистрационное удостоверение № ФСР 2012/13239. от 20 марта 2012 г.
НАЗНАЧЕНИЕ[1]
Выявление и определение титра видоспецифических антител класса M к вирусу краснухи в сыворотке (плазме) крови человека методом иммуноферментного анализа (ИФА) на твердофазном носителе в варианте “capture” при “ручной” постановке и с использованием ИФА-анализаторов.
СОСТАВ И БАЗОВАЯ КОМПЛЕКТАЦИЯ НАБОРА
| Иммуносорбент | очищенные антитела к IgM человека, сорбированные на 96-луночном разборном полистироловом планшете для иммунологических реакций с плоским дном (используются “ломающиеся” стрипы) | 1 планшет |
| допускается раздельная упаковка стрипов (по 1-4 стрипа в пакете) | ||
| Контрольный положительный образец (К+) | инактивированный, содержит антитела класса M к вирусу краснухи в титре 1:800; прозрачная жидкость красного цвета. | 1 фл.
(1,5 мл) |
| Контрольный образец уровня среза (К+пор) | инактивированный; содержит антитела класса M к вирусу краснухи в “пороговом” титре (1:100); прозрачная жидкость желтого цвета. | 1 фл.
(1,5 мл) |
| Контрольный отрицательный образец (К–) | инактивированный; прозрачная, зеленого цвета, жидкость | 1 фл.
(1,5 мл) |
| Конъюгат | нативный очищенный инактивированный антиген вируса краснухи, меченный пероксидазой, прозрачная жидкость желтого цвета | 1 фл.
(13 мл) |
| Раствор для разведения образцов (РРО) | прозрачная жидкость зеленого цвета | 1 фл. (100 мл)
или 2 фл. (по 50 мл) |
| 25-кратный концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином [ФСБ-Т(х25)] | слегка опалесцирующая бесцветная пенящаяся жидкость, возможно выпадение осадка солей белого цвета, растворяющегося при температуре 37 0С в течение 30 мин | 1 фл. (80 мл)
или 2 фл. (по 40 мл) |
| Раствор индикаторный (РИ); | прозрачная бесцветная жидкость | 1 фл.
(13 мл) |
| Стоп-реагент | прозрачная бесцветная жидкость | 1 фл.
(12,5 мл) |
Примечания. 1. Набор включает все реагенты, необходимые для постановки ИФА, кроме очищенной (дистиллированной или деионизированной) воды.
- ФСБ-Т(х25), РИ, стоп-реагент – унифицированы для всех наборов ЗАО “ЭКОлаб”, в которых используются указанные реагенты.
Дополнительно набор может быть укомплектован:
вспомогательными пластиковыми емкостями (4 шт.),
стрипированным планшетом для предварительного разведения образцов
(1 шт.),
одноразовыми наконечниками для автоматических пипеток (16 шт.),
клейкой пленкой для планшетов (4 шт.).
Компоненты набора упакованы в коробку, в коробку вложена инструкция по применению и бланк калибровочного графика.
По желанию потребителя базовая комплектация набора (число индивидуальных упаковок с реагентами и их объемы) может быть изменена.
ОСНОВНЫЕ ПОТРЕБИТЕЛЬСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Базовый вариант комплектации набора позволяет одномоментное исследование 96 образцов, включая контрольные (на контрольные образцы используется 6 лунок и 1 лунка – для определения уровня “бланк”). Предусмотрена возможность проведения раздельных исследований с использованием необходимого количества стрипов:
| Число стрипов | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| Число иссл. обр. | 1 | 2-9 | 10-17 | 18-25 | 26-33 | 34-41 | 42-49 | 50-57 | 58-65 | 66-73 | 74-81 | 82-89 |
ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ
При наличии в исследуемом образце антител класса M к вирусу краснухи антитела, сорбированные на поверхности лунок полистиролового планшета, связываются с IgM антителами сыворотки крови. Конъюгат – антиген вируса краснухи, меченный пероксидазой хрена, связывается с IgM-антителами, специфическими к вирусу краснухи. Присутствие в сыворотке специфических IgG-антител, ревматоидного фактора и антинуклеарных антител потенциально не оказывает влияния на результаты реакции. Образовавшийся комплекс “антитело-антитело-конъюгат” выявляется по реакции с субстратом пероксидазы – тетраметилбензидином, в результате которой меняется цвет (оптическая плотность) реакционной смеси в лунке планшета; изменение регистрируется с помощью спектрофотометра.
АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Аналитическая чувствительность (минимальный титр IgМ-антител к вирусу краснухи, выявляемый набором) – 1:100.
Набор рассчитан на определение титра антител класса M к вирусу краснухи в диапазоне от 1:100 до 1:800.
Коэффициент вариации ОП контрольных сывороток (К+ и К+пор) – не более 10 %.
ИССЛЕДУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ
Нативная сыворотка (плазма) крови человека объемом не менее 10 мкл.
Образцы сыворотки (плазмы) крови до исследования можно хранить не более 7 сут при температуре от 2 до 8 оС и 3 мес при температуре минус 20 оС или более низкой. Допускается только однократное замораживание-размораживание образцов. Размороженные образцы перед исследованием тщательно перемешать.
Не допускается использование для исследования образцов с повышенным содержанием липидов и (или) с признаками гемолиза, и (или) с видимым микробным проростом.
Образцы, содержащие осадок, перед анализом отцентрифугировать в течение 10-15 мин при 2500-3000 об/мин.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Набор биологически безопасен, однако с исследуемыми образцами необходимо обращаться как с потенциально инфицированным материалом.
Стоп-реагент при попадании на незащищенную кожу и слизистые может вызывать химические ожоги. В случае попадания на кожу – немедленно промойте пораженный участок водой.
Класс потенциального риска применения в медицинских целях по ГОСТ Р 51609-2000 – 2б.
СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ
Оборудование и материалы (для “ручной” постановки)
Дозаторы пипеточные (пипетки полуавтоматические одно- и многоканальные переменного объема) для внесения реагентов в лунки планшета с погрешностью дозирования не более 5 % с наконечниками полипропиленовыми одноразовыми.
Ручные, или автоматические промыватели, или восьми- и двенадцатиканальные пипеточные дозаторы для промывания лунок планшета.
Спектрофотометр вертикального сканирования для измерения оптической плотности в лунках планшета при 450 нм и/или в двухволновом режиме при основной длине волны 450 нм и длине волны сравнения в диапазоне 620-650 нм.
Центрифуга лабораторная на 2,5-3,0 тыс. об/мин, термостат на 37 оС, холодильник бытовой, фильтровальная бумага.
Вода очищенная (дистиллированная или деионизированная).
70 %-ный раствор спирта этилового и 6 %-ный раствор перекиси водорода (дез.растворы) или растворы иных дезинфектантов, разрешенных к применению СП 1.32322-08, кроме хлорсодержащих.
Приготовление рабочих растворов реагентов для ИФА
Перед работой извлечь набор из холодильника, вскрыть упаковку и выдержать все реагенты перед проведением анализа не менее 30 мин при температуре от 18 до 25 оС.
Приготовление рабочих разведений исследуемых образцов
По 10 мкл каждого образца смешайте с 1 мл РРО (разведение 1:100), тщательно перемешайте пипетированием.
Для предварительного разведения образцов можно использовать вспомогательный планшет; для этого внести в необходимое число его лунок по 90 мкл РРО, затем внести в них по 10 мкл исследуемых образцов, тщательно перемешать пипетированием (разведение 1:10). Рабочее разведение (1:100) будет получено непосредственно в лунках иммуносорбента.
Рабочие разведения образцов хранить не более 3 ч при температуре от 18 до 25 оС.
Приготовление рабочего промывочного раствора (ФСБ-Т)
При выпадении осадка солей в ФСБ-Т(х25) прогреть его при температуре 37 оС до полного растворения осадка.
При постановках с использованием ИФА-анализаторов 80 мл ФСБ-Т(х25) довести водой очищенной до 2 л.
При дробной “ручной” постановке использовать соотношения объемов ФСБ-Т(х25) и воды, указанные в табл. 1 для разного числа используемых стрипов.
Таблица 1
| Число стрипов | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| ФСБ-Т(х25), мл | 7 | 10 | 13 | 17 | 20 | 23 | 27 | 30 | 33 | 37 | 40 |
| Вода очищенная, мл | до 175 | до 250 | до 325 | до 425 | до 500 | до 575 | до 675 | до 750 | до 825 | до 925 | до 1000 |
Готовый рабочий промывочный раствор хранить при температуре от 2 до 8 ºС не более 14 сут.
Приготовление остальных реагентов
Иммуносорбент, К+, К–, К+пор, РРО, конъюгат, РИ, стоп-реагент – готовы к применению.
После вскрытия упаковок неиспользованные реагенты (кроме иммуносорбента) хранить в плотно закрытой упаковке при температуре от 2 до 8 оС до истечения срока годности.
Проведение ИФА (“ручная” постановка)
Внимание! Соблюдение указанных ниже температуры и времени инкубации планшетов на каждой стадии постановки крайне важно для получения достоверных результатов.
- Извлечь рамку планшета с необходимым числом стрипов. Неиспользованные стрипы из вскрытого пакета хранить в плотно закрытом пакете при температуре от 2 до 8 оС до истечения срока годности.
- Одну лунку (напр., А1) оставить незаполненной.
Внести (соблюдая указанную последовательность):
в две лунки (напр., B1, C1) – по 100 мкл К+,
в две лунки (напр., D1, E1) – по 100 мкл К+пор,
в две лунки (напр., F1, G1) – по 100 мкл К–,
в следующие лунки – по 100 мкл подготовленных исследуемых образцов (по 1 лунке на образец). При использовании вспомогательного планшета для разведения образцов в соответствующие лунки иммуносорбента внести по 90 мкл РРО, а затем – по 10 мкл образцов, разведенных 1:10 в лунках вспомогательного планшета, тщательно перемешать пипетированием.
Накрыть планшет липкой пленкой .
- Инкубировать 60 мин при температуре 37оС в защищенном от света месте.
- С помощью промывателя удалить образцы из лунок, 4 раза промыть планшет промывочным раствором, внося в лунки 350-370 мкл раствора. При наличии промывателя, позволяющего производить промывку в режиме “Overflow”, использовать именно этот режим. По окончании промывки удалить остатки влаги из лунок, постукивая планшетом по фильтровальной бумаге, положенной на полиэтиленовую пленку.
При ручной отмывке заполненные ФСБ-Т лунки выдерживать не менее 1 мин.
- Во все лунки (кроме лунки А1) внести по 100 мкл конъюгата.
- Планшет закрыть клейкой пленкой. Инкубировать 30 мин при температуре 37 оС в защищенном от света месте.
- С помощью промывателя удалить жидкость из лунок, 4 раза промыть планшет как указано в п. 4.
При ручной промывке промыть планшет 5 раз. Заполненные ФСБ-Т лунки выдерживать не менее 1 мин.
- Во все лунки внести по 100 мкл раствора индикаторного, немедленно поместить планшет в защищенное от света место и выдержать 30 мин при температуре от 21 до 25 оС.
- Во все лунки (в той же последовательности, с которой вносился индикаторный раствор внести по 100 мкл стоп-реагента, осторожно (постукиванием по планшету) перемешать содержимое лунок и не более чем через 10-15 мин приступить к учету результатов.
Регистрация и учет результатов
Результаты ИФА регистрировать спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность (ОП) при двух длинах волн – 450 нм и 620-650 нм. При отсутствии референс-фильтра на 620-650 нм оптическую плотность (ОП) измерять при длине волны 450 нм. Оптический нуль фотометра (“бланк”) устанавливается против воздуха.
Результаты ИФА учитываются при следующих условиях:
среднее значение ОП(К+) ≥0,50;
среднее значение ОП(К+пор) ≥0,20;
отношение ОП(К–)/ ОП(К+пор) ≤0,50;
значение ОП “бланк” ≤0,15;
среднее значение ОП(К–) ≤0,15.
В противном случае исследование необходимо повторить.
Качественный учет результатов
Исследуемые образцы учитываются:
как положительные при ОП >1,1× ОП(К+пор),
как отрицательные при ОП <0,9× ОП(К+пор).
Образцы с ОП в пределах от 0,9× ОП(К+пор) до 1,1× ОП(К+пор), т.е. в так называемой “серой” зоне, рекомендуется исследовать повторно, поскольку результаты, полученные в ней, не могут быть однозначно интерпретированы.
При повторном получении указанного результата, рекомендуется мониторинг наличия антител у пациента для исключения неспецифических реакций, которые также могут давать сомнительные результаты.
Полуколичественный учет результатов
В образцах, оцененных как положительные, может быть определен титр IgM-антител к вирусу краснухи, для чего на бланке калибровочного графика по точкам, ординатами которых (пропорциональная шкала) служат полученные значения ОП(К+) и ОП(К+пор), а абсциссами (логарифмическая шкала) – значения титров IgM-антител в К+ и К+пор (1:800 и 1:100), следует провести прямую линию и найти на ней точку, ординатой которой является полученное значение ОП исследуемого образца; абсцисса указанной точки будет соответствовать искомому значению титра IgM-антител.
ПОСТАНОВКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИФА-АНАЛИЗАТОРОВ
Подготовить прибор в соответствии с инструкцией по его эксплуатации, ввести программу анализа, соответствующую используемому набору, и провести анализ.
СРОК ГОДНОСТИ
Срок годности набора – 1 год. Набор с истекшим сроком годности применению не подлежит.
ХРАНЕНИЕ И ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ
Хранение
В упаковке предприятия-изготовителя при температуре от 2 до 8 оС. Замораживание не допускается.
Транспортирование
При температуре от 2 до 8 оС. Замораживание не допускается. Допускается транспортирование при температуре от 9 до 25 оС в течение 10 сут.
УСЛОВИЯ ОТПУСКА
Для учреждений здравоохранения.
По вопросам, касающимся качества набора «ИФА-Краснуха-IgM», следует обращаться по адресу 142530 Московская обл., г. Электрогорск, ул. Буденного, д. 1, ЗАО “ЭКОлаб”; тел. (49643) 3-23-11, факс (49643) 3-30-93 – отдел сбыта, (49643) 3-37-30 – ОБТК и в учреждение, уполномоченное Росздравнадзором на проведение государственного контроля качества указанной продукции.
КРАТКАЯ СХЕМА ПОСТАНОВКИ ИФА
(ИФА-Краснуха-IgM)
| Использовать только после тщательного ознакомления с инструкцией! | |
| Внести | лунку А1 оставить незаполненной;
в лунки B1, C1 – по 100 мкл К+, в лунки D1, E1 – по 100 мкл К+пор, в лунки F1, G1 – по 100 мкл К–, в следующие лунки – по 100 мкл подготовленных исследуемых образцов (по 1 лунке на образец) |
| Инкубация | 60 мин, 37 оС |
| Промыть | 4 раза ФСБ-Т |
| Внести | по 100 мкл конъюгата в каждую лунку (кроме А1) |
| Инкубация | 30 мин, 37 оС |
| Промыть | 4 раза ФСБ-Т (при использовании вошера) или 5 раз при ручной промывке |
| Внести | по 100 мкл индикаторного раствора в каждую лунку |
| Инкубация | 30 мин, 21-25 оС |
| Внести | по 100 мкл стоп-реагента в каждую лунку |
| Измерить | ОП при 450 нм (референс 620-650 нм), «бланк» – по воздуху |
Май 2014 г.
[1] Взамен инструкции, утвержденной 22.12.2006 г.
