И Н С Т Р У К Ц И Я по применению набора реагентов «Тест-система иммуноферментная для выявления иммуноглобулинов класса G к антигенам рода Opisthorchis» “ИФА-Описторхоз-lgG”
Регистрационное удостоверение №РЗН 2016/4997 от 15.11.2016
НАЗНАЧЕНИЕ
Набор реагентов «Тест-система иммуноферментная для выявления иммуноглобулинов класса G к антигенам рода Opisthorchis» «ИФА-Описторхоз- IgG» предназначен для выявления иммуноглобулинов класса G к антигенам рода Opisthorchis в сыворотке (плазме) крови человека методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) при “ручной” постановке и с использованием ИФА-анализаторов.
СОСТАВ И КОМПЛЕКТАЦИЯ НАБОРА
Иммуносорбент | очищенный инактивированный антиген описторхисов сорбированный на 96-луночном разборном полистироловом планшете для иммунологических реакций с плоским дном | 1 планшет |
допускается раздельная упаковка стрипов (по 1-4 стрипа в пакете) | ||
Контрольный положительный образец (К+) | инактивированный; прозрачная или слегка опалесцирующая жидкость красного цвета | 1 фл. (1,5 мл) |
Контрольный отрицательный образец (К–) | инактивированный; прозрачная или слегка опалесцирующая жидкость желтого цвета | 1 фл. (2,5 мл) |
Конъюгат | прозрачная или опалесцирующая жидкость зеленого цвета | 1 фл. (14 мл) |
25-кратный концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином [ФСБ-Т(х25)] | прозрачная или слегка опалесцирующая пенящаяся жидкость, возможно выпадение осадка солей белого цвета, растворяющегося при температуре 37 0С в течение 30 мин. | 1 фл. (40 мл) |
Раствор для разведения образцов (РРО) | прозрачная или опалесцирующая жидкость фиолетового цвета | 1 фл. (14 мл) |
Раствор индикаторный (РИ); | прозрачная бесцветная или светло-желтого цвета жидкость | 1 фл. (14 мл) |
Стоп-реагент | прозрачная бесцветная жидкость | 1 фл. (12,5 мл) |
Примечания. 1. Набор включает все реагенты, необходимые для постановки ИФА, кроме очищенной (дистиллированной или деионизированной) воды.
- ФСБ-Т(х25), РИ, стоп-реагент – унифицированы для всех наборов ЗАО “ЭКОлаб”, в которых используются указанные реагенты.
Набор дополнительно укомплектован принадлежностями:
вспомогательными пластиковыми емкостями размером 100х50х19 мм (4 шт.),
одноразовыми наконечниками для автоматических пипеток (16 шт.);
клейкой пленкой для планшетов размером 85х135 мм (4 шт.).
Компоненты набора упакованы в коробку, в коробку вложена инструкция по применению.
ОСНОВНЫЕ ПОТРЕБИТЕЛЬСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Базовый вариант комплектации набора позволяет исследование 96 образцов, включая контрольные (на контрольные образцы используется 3 лунки). Предусмотрена возможность проведения раздельных исследований с использованием необходимого количества стрипов:
Число
стрипов |
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
Число иссл. образцов | 1-5 | 6-13 | 14-21 | 22-29 | 30-37 | 38-45 | 46-53 | 54-61 | 62-69 | 70-77 | 78-85 | 86-93 |
ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ ИФА-Описторхоз-lgG
При наличии в исследуемом образце иммуноглобулинов класса G к антигенам рода Opisthorchis происходит связывание их с антигенами описторхисов, сорбированными в лунках планшета-иммуносорбента, образовавшийся комплекс антиген-антитело реагирует с внесенным в реакционную среду раствором конъюгата – антителами к IgG человека, меченными пероксидазой. Образовавшийся комплекс “антиген-антитело-конъюгат” выявляется в реакции с субстратно-индикаторным раствором, содержащим хромоген – тетраметилбензидин, в результате которой меняется цвет (оптическая плотность) реакционной смеси в лунке планшета; изменение регистрируется спектрофотометрически.
АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА
Аналитическая чувствительность набора определяется по стандартной панели положительных сывороток предприятия, содержащих иммуноглобулины класса G к антигенам рода Opisthorchis (СОП+-174), как процентное содержание образцов, определенных набором как положительные, и составляет 100%.
Аналитическая специфичность набора определяется по стандартной панели отрицательных сывороток предприятия, не содержащих иммуноглобулины класса G к антигенам рода Opisthorchis (СОП–-174) как процентное содержание образцов, определенных набором как отрицательные, и составляет 100%.
Диагностическая чувствительность (с доверительной вероятностью 95%) составила:
Сыворотка крови человека-99,52% – 100%
Плазма крови человека- 99,55% – 100%
Диагностическая специфичность (с доверительной вероятностью 95%) составила:
Сыворотка крови человека-99,64% – 100%
Плазма крови человека-99,66% – 100%
ИССЛЕДУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ
Нативная сыворотка (плазма) крови человека объемом не менее 40 мкл.
Образцы сыворотки (плазмы) крови до исследования можно хранить не более 7 сут. при температуре от 2 до 8 оС и 3 мес при температуре минус 20 оС или более низкой. Допускается только однократное замораживание-размораживание образцов. Размороженные образцы перед исследованием тщательно перемешать.
Не допускается использование для исследования образцов с повышенным содержанием липидов и (или) с признаками гемолиза, и (или) с видимым микробным проростом.
Образцы, содержащие осадок, перед анализом отцентрифугировать в течение 10-15 мин при 2500-3000 об/мин.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
И ОСНОВНЫЕ ПРАВИЛА РАБОТЫ С НАБОРОМ ИФА-Описторхоз-lgG
Потенциальный риск применения набора – класс 2б (Приказ №4н от 06.06.12.).
Набор биологически безопасен, однако с исследуемыми образцами необходимо обращаться как с потенциально инфицированным материалом.
Стоп-реагент при попадании на незащищенную кожу и слизистые может вызывать химические ожоги. В случае попадания на кожу – немедленно промойте пораженный участок водой.
Утилизацию или уничтожение, дезинфекцию наборов реагентов следует проводить в соответствии с СанПиН 2.1.7.2790-10 “Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами” и МУ 287-113 “Методические указания по дезинфекции, предстерилизационной очистке и стерилизации изделий медицинского назначения”.
СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ ИФА-Описторхоз-lgG
Оборудование и материалы
Дозаторы пипеточные (пипетки полуавтоматические одно- и многоканальные переменного объема) для внесения реагентов в лунки планшета с погрешностью дозирования не более 5 % с наконечниками полипропиленовыми одноразовыми.
Ручные, или автоматические промыватели, или восьми- и двенадцатиканальные пипеточные дозаторы для промывания лунок планшета.
Спектрофотометр вертикального сканирования для измерения оптической плотности в лунках планшета при 450 нм и/или в двухволновом режиме при основной длине волны 450 нм и длине волны сравнения в диапазоне 620-650 нм.
Центрифуга лабораторная на 2,5-3,0 тыс. об/мин, термостат на 37 оС, холодильник бытовой, фильтровальная бумага, ИФА-анализатор.
Вода очищенная (дистиллированная или деионизированная).
70 %-ный раствор спирта этилового и 6 %-ный раствор перекиси водорода (дез.растворы) или растворы иных дезинфектантов, разрешенных к применению СП 1.32322-08, кроме хлорсодержащих.
Приготовление рабочих растворов реагентов для ИФА
Перед работой извлечь набор из холодильника, вскрыть упаковку и выдержать все реагенты перед проведением анализа не менее 30 мин при температуре от 18 до 25 оС.
Приготовление рабочего промывочного раствора (ФСБ-Т)
При выпадении осадка солей в ФСБ-Т(х25) прогреть его при температуре 37 оС до полного растворения осадка.
В зависимости от числа используемых стрипов отобрать необходимый объем концентрата и довести его водой очищенной до объема, указанного в табл. 1
Таблица 1
Реагент | Объем реагента, мл, на …..стрипов | |||||||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
ФСБ-Т(х25) | 3 | 7 | 10 | 13 | 17 | 20 | 23 | 27 | 30 | 33 | 37 | 40 |
Вода очищенная | до 75 | до 175 | до 250 | до 325 | до 425 | до 500 | до 575 | до 675 | до 750 | до 825 | до 925 | до 1000 |
Готовый рабочий промывочный раствор хранить при температуре от 2 до 8 ºС не более 14 сут.
Приготовление остальных реагентов
Иммуносорбент, К+, К–, РРО, конъюгат, РИ, стоп-реагент – готовы к применению.
Проведение ИФА (“ручная” постановка)
Внимание! Соблюдение указанных ниже температуры и времени инкубации планшетов на каждой стадии постановки крайне важно для получения достоверных результатов.
- Извлечь из упаковки рамку планшета и необходимое число стрипов.
- Стрипы промыть 1 раз ФСБ-Т, внося в лунки 350-370 мкл раствора. При наличии промывателя, позволяющего производить промывку в режиме “Overflow”, использовать именно этот режим. По окончании промывки остатки раствора удалить из лунок, постукивая перевернутым планшетом по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге.
- Внести в три лунки контрольные образцы (в одну лунку – 100 мкл К+, в две лунки – по 100 мкл К–). В остальные лунки внести по 100 мкл РРО. Затем в лунки с РРО внести по 20 мкл исследуемых образцов, содержимое лунок перемешать пипетированием (при этом цвет РРО должен измениться).
Примечание. При постановке ИФА на одном стрипе допускается использовать по 1 лунке на каждый контрольный образец.
- Планшет закрыть крышкой или заклеить клейкой лентой. Инкубировать 30 мин при температуре 37оС в защищенном от света месте.
- С помощью промывателя удалить образцы из лунок, 5 раз промыть планшет промывочным раствором, как указано в п. 2.
- В лунки внести по 100 мкл конъюгата. Инкубировать 30 мин при температуре 37оС в защищенном от света месте.
- С помощью промывателя удалить жидкость из лунок, 5 раз промыть планшет как указано в п. 2.
- Во все лунки внести по 100 мкл раствора индикаторного, немедленно поместить планшет в защищенное от света место и выдержать 15 мин при температуре 37оС.
- Во все лунки (в той же последовательности, с которой вносился субстратно-индикаторный раствор) внести по 100 мкл стоп-реагента, осторожно (постукиванием по планшету) перемешать содержимое лунок и не более чем через 5 мин приступить к учету результатов.
Регистрация и учет результатов
Результаты ИФА регистрировать спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность (ОП) при двух длинах волн – 450 нм и 620-650 нм. При отсутствии референс-фильтра на 620-650 нм ОП измерять при длине волны 450 нм, а выведение спектрофотометра на нулевой уровень (“бланк”) осуществлять по воздуху.
Результаты ИФА учитываются только при следующих условиях:
среднее значение ОП(К+) – не менее 0,50;
среднее значение ОП(К–) – не более 0,20,
В противном случае исследование необходимо повторить.
Рассчитать критическое значение оптической плотности, ОПкрит., по формуле
ОПкрит.= ОП(К‾ср)+0,35,
где ОП(К‾ср) – среднее значение ОП в лунках с К‾;
0,35 – коэффициент, полученный экспериментальным путем.
При ОПиссл.обр больше 1,2×ОПКрит образец считается положительным и содержащим иммуноглобулины класса G к антигенам Opisthorchis.
При ОПиссл.обр меньше 0,9×ОПКрит образец считается отрицательным, т.е. не содержащим иммуноглобулины класса G к антигенам Opisthorchis.
При ОПиссл.обр в интервале от 0,9×ОПКрит до 1,2×ОПКрит образец считается сомнительным; исследование такого образца рекомендуется повторить.
Интерпретацию результатов анализа проводит лечащий врач с учетом клинических признаков и результатов прямых методов анализа (дуоденальное зондирование, копроовоскопия).
Следует учитывать возможность перекреста иммунологических реакций при заболеваниях аскаридозом, трихинеллезом, токсокарозом и эхинококкозом. Это может быть связано как с совместной инвазией, так и с взаимодействием антител с гетерологичным антигеном за счет наличия общих антигенных компонентов.
Титрование положительного образца
Тест-система позволяет выполнить определение титра антител в выявленном положительном образце. Для этого, на отдельном стрипе необходимо провести ИФА с соответствующим образцом в последовательных двукратных разведениях его раствором РРО от 1:10 до 1:1280.
Для приготовления указанных разведений в верхнюю лунку стрипа внести 180 мкл раствора РРО, в остальные лунки стрипа – по 100 мкл раствора РРО. Затем в верхнюю лунку стрипа внести 20 мкл выявленного положительного образца, тщательно перемешать пипетированием и перенести 100 мкл полученного разведения (1:10) во вторую лунку, тщательно перемешать пипетированием, перенести 100 мкл полученного разведения (1:20) в третью лунку и так – до последней лунки стрипа. Из последней лунки стрипа отобрать 100 мкл разведения (1:1280) и слить его в дезинфицирующий раствор.
Далее провести ИФА как указано в п. Проведение ИФА (“ручная” постановка).
ПОСТАНОВКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИФА-АНАЛИЗАТОРОВ
Подготовить прибор в соответствии с инструкцией по его эксплуатации, ввести программу анализа, соответствующую используемому набору, и провести анализ.
СРОК ГОДНОСТИ
Срок годности набора – 1 год. Набор с истекшим сроком годности применению не подлежит.
ХРАНЕНИЕ И ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ
Хранение
Хранение наборов должно осуществляться в холодильных камерах или холодильниках, обеспечивающих регламентируемый температурный режим, в упаковке предприятия-изготовителя при температуре от 2 до 8 оС в течение всего срока годности.
После вскрытия упаковок неиспользованные реагенты допускается хранить в плотно закрытых упаковках в холодильных камерах или холодильниках, обеспечивающих регламентируемый температурный режим, при температуре от 2 до 8 оС до истечения срока годности.
Транспортирование
Транспортирование наборов – при температуре от 2 до 8 оС транспортом всех видов в крытых транспортных средствах в соответствии с правилами перевозок, действующими на транспорте данного вида. Допускается транспортирование при температуре от 9 до 25 оС в течение 10 сут.
УСЛОВИЯ ОТПУСКА
Для учреждений здравоохранения.
По вопросам, касающимся качества и обращения набора «Тест-система иммуноферментная для выявления иммуноглобулинов класса G к антигенам рода Opisthorchis “ИФА-Описторхоз-IgG”, следует обращаться по адресу 142530 Московская обл., г. Электрогорск, ул. Буденного, д. 1. ЗАО “ЭКОлаб”; тел.(49643) 3-23-11, факс (49643) 3-30-93 – отдел сбыта, (49643) 3-37-30 – ОБТК.
КРАТКАЯ СХЕМА ПОСТАНОВКИ ИФА
(“ИФА-Описторхоз-IgG”)
Использовать только после тщательного ознакомления с инструкцией!
Промыть | 1 раз промывочным раствором |
Внести | в три лунки контрольные образцы (в одну лунку – 100 мкл К+, в две лунки – по 100 мкл К–); в остальные лунки внести по 100 мкл РРО. Затем в лунки с РРО внести по 20 мкл исследуемых образцов |
Инкубация | 30 мин, 37 0С |
Промыть | 5 раз промывочным раствором |
Внести | по 100 мкл конъюгата в каждую лунку |
Инкубация | 30 мин, 37 0С |
Промыть | 5 раз промывочным раствором |
Внести | по 100 мкл индикаторного раствора в каждую лунку |
Инкубация | 15 мин, 37 0С |
Внести | по 100 мкл стоп-реагента в каждую лунку |
Измерить | ОП при 450 нм (референс 620-650 нм), «бланк» – по воздуху. |