ИФА-Токсо-IgG

ИНСТРУКЦИЯ по применению набора реагентов  “ИФА-Токсо-IgG”

 Тест-система иммуноферментная для выявления антител класса G к Toxoplasma gondii

 Регистрационное удостоверение №ФСР 2011/12071 от “30”сентября 2011 г.

НАЗНАЧЕНИЕ[1]

Выявление и определение содержания видоспецифических антител класса G к Toxoplasma gondii в сыворотке (плазме) крови людей методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) на твердофазном носителе  при “ручной” постановке и с использованием ИФА-анализаторов.

СОСТАВ И КОМПЛЕКТАЦИЯ НАБОРА

Иммуносорбент	Лизатный инактивированный очищенный видоспецифический токсоплазменный антиген, сорбированный на 96-луночном разборном полистироловом планшете для иммунологических реакций с плоским дном (используются «ломающиеся» стрипы);	1 планшет
	допускается раздельная упаковка стрипов (по 1-4 стрипа в пакете)
Контрольные положительные образцы 1, 2, 3 и 4, (К+1, К+2, К+3, К+4)	инактивированные; К+1 содержит 10 МЕ/мл антител класса G к Toxoplasma gondii, К+2 – 50 МЕ/мл, К+3 – 100 МЕ/мл, К+4 – 200 МЕ/мл (содержание антител указывается также на этикетках контрольных положительных образцов). К+1 – прозрачная,  желтого цвета, жидкость; К+2, К+3, К+4 – прозрачная жидкость красного цвета.	по 1 фл. (1,2 мл)
Контрольный отрицательный образец (К–)	инактивированный; прозрачная, зеленого цвета, жидкость	1 фл. (1,2 мл)
Конъюгат	антитела моноклональные мышиные против иммуноглобулинов человека класса G, меченые пероксидазой хрена; прозрачная жидкость розового цвета	1 фл. (13 мл)
Раствор для разведения образцов (РРО)	прозрачная жидкость синего цвета	1 фл. (15 мл)
Раствор для предварительного разведения образцов (РПРО)	прозрачная жидкость розового цвета	1 фл. (по 15 мл)
25-кратный концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином [ФСБ-Т(х25)]	прозрачная или слегка опалесцирующая бесцветная пенящаяся жидкость, возможно выпадение осадка солей белого цвета, растворяющегося при температуре 37 0С в течение 30 мин.	1 фл. (80 мл) или 2 фл. (по 40 мл)
Раствор индикаторный (РИ)	прозрачная бесцветная жидкость.]	1 фл. (13 мл)
Стоп-реагент	прозрачная бесцветная жидкость.	1 фл. (12,5 мл)

Примечания. 1. Набор включает все реагенты, необходимые для постановки ИФА, кроме очищенной (дистиллированной или деионизированной) воды.

2. ФСБ-Т(х25), РИ, РРО,РПРО, стоп-реагент – унифицированы для всех наборов ЗАО “ЭКОлаб”, в которых используются указанные реагенты.

Дополнительно набор может быть укомплектован:

вспомогательными пластиковыми емкостями (4 шт.),

стрипированным планшетом для предварительного разведения образцов (1 шт.),

одноразовыми наконечниками для автоматических пипеток (16 шт.)

клейкой пленкой для планшетов (4 шт.).

Компоненты набора упакованы в коробку, в коробку вложена инструкция по применению и бланк калибровочного графика.

По желанию потребителя базовая комплектация набора (число индивидуальных упаковок с реагентами и их объемы) может быть изменена.

ОСНОВНЫЕ ПОТРЕБИТЕЛЬСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Базовый вариант комплектации набора позволяет одномоментное исследование 96 образцов, включая контрольные (на контрольные образцы используется 10 лунок и 1 лунка – для определения уровня “бланк”). Предусмотрена возможность проведения раздельных исследований с использованием необходимого количества стрипов:

Число стрипов	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
Число исслед. обр.	1-5	6-13	14-21	22-29	30-37	38-45	46-53	54-61	62-69	70-77	78-85

ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ

При наличии в исследуемом образце антител класса G к Toxoplasma gondii антиген, сорбированный на поверхности лунок полистиролового планшета, связывается с антителами; этот комплекс, в свою очередь, связывается с конъюгатом – антителами против IgG человека, мечеными пероксидазой хрена. Образовавшийся комплекс “антиген-антитело-конъюгат” выявляется по реакции с субстратом пероксидазы – тетраметилбензидином, в результате которой меняется цвет (оптическая плотность) реакционной смеси в лунке планшета; изменение регистрируется с помощью спектрофотометра.

АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Диагностическая чувствительность набора при определении на сыворотках стандартной панели предприятия, содержащих антитела класса G  к Toxoplasma gondii – 100 %.

Диагностическая специфичность набора при определении на сыворотках стандартной панели предприятия, не содержащих антитела класса G  к Toxoplasma gondii  – 100 %”.

Аналитическая чувствительность (минимальное определяемое содержание иммуноглобулинов класса G к Toxoplasma gondii) – не более 5 МЕ/мл.

Набор рассчитан на определение содержания антител класса G к Toxoplasma gondii в диапазоне от 10 МЕ/мл до 200 МЕ/мл.

ИССЛЕДУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ

Нативная сыворотка (плазма) крови человека объемом не менее 10 мкл.

Образцы сыворотки (плазмы) крови до исследования можно хранить не более 7 сут. при температуре от 2 до 8 ^оС и 3 мес при температуре минус 20 ^оС или более низкой. Допускается только однократное замораживание-размораживание образцов. Размороженные образцы перед исследованием тщательно перемешать.

Не допускается использование для исследования образцов с повышенным содержанием липидов и (или) с признаками гемолиза, и (или) с видимым микробным проростом.

Образцы, содержащие осадок, перед анализом отцентрифугировать в течение 10-15  мин при 2500-3000 об/мин.

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

Набор биологически безопасен, однако с исследуемыми образцами необходимо обращаться как с потенциально инфицированным материалом.

Стоп-реагент при попадании на незащищенную кожу и слизистые может вызывать химические ожоги. В случае попадания на кожу – немедленно промойте пораженный участок водой.

СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ

Оборудование и материалы (для “ручной” постановки)

Дозаторы пипеточные (пипетки полуавтоматические одно- и многоканальные переменного объема) для внесения реагентов в лунки планшета с погрешностью дозирования не более 5 % с наконечниками полипропиленовыми одноразовыми.

Ручные, или автоматические промыватели, или восьми- и двенадцатиканальные пипеточные дозаторы для промывания лунок планшета.

Спектрофотометр вертикального сканирования для измерения оптической плотности в лунках планшета при 450 нм и/или в двухволновом режиме при основной длине волны 450 нм и длине волны сравнения в диапазоне 620-650 нм.

Центрифуга лабораторная на 2,5-3,0 тыс. об/мин, термостат на 37 ^оС, холодильник бытовой, фильтровальная бумага.

Вода очищенная (дистиллированная или деионизированная).

70 %-ный раствор спирта этилового и 6 %-ный раствор перекиси водорода (дез.растворы) или растворы иных дезинфектантов, разрешенных к применению СП 1.32322-08, кроме хлорсодержащих.

Приготовление рабочих  растворов реагентов для ИФА

Перед работой извлечь набор из холодильника, вскрыть упаковку и выдержать все реагенты перед проведением анализа не менее 30 мин при температуре  от 18 до 25 ^оС.

Предварительное  разведение исследуемых образцов

Исследуемые образцы развести 1:10 во вспомогательном планшете. Для этого внести в его лунки по 90 мкл РПРО и добавить по 10 мкл сыворотки, тщательно перемешать пипетированием. При этом розовый цвет должен измениться на желтый. Если изменение цвета не произошло, данный образец необходимо исследовать повторно с целью исключения неправильных результатов. Рабочее разведение (1:100) готовить непосредственно в лунках иммуносорбента (см. раздел Проведение ИФА (“ручная” постановка), п. 2).

Рабочие разведения образцов хранить не более 6 ч при температуре  от 18 до
25 ^оС.

 

Приготовление рабочего промывочного раствора  (ФСБ-Т)

При выпадении осадка солей в ФСБ-Т(х25) прогреть его при температуре  37 ^оС до  полного растворения осадка.

При постановках с использованием ИФА-анализаторов 80 мл ФСБ-Т(х25) довести водой очищенной до 2 л.

При дробной “ручной” постановке использовать соотношения объемов ФСБ-Т(х25) и воды, указанные в табл. 1 для разного числа используемых стрипов.

Таблица 1

Число стрипов	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
ФСБ-Т(х25), мл	7	10	13	17	20	23	27	30	33	37	40
Вода очищенная, мл	до 175	до 250	до 325	до 425	до 500	до 575	до 675	до 750	до 825	до 925	до 1000

Готовый рабочий промывочный раствор хранить при температуре от 2 до 8 ºС не более 14 сут.

Приготовление остальных реагентов

К^–,  К⁺₁, К⁺₂, К⁺₃, К⁺_4, РИ, РРО, РПРО, конъюгат, стоп-реагент – готовы к применению.

После вскрытия упаковок неиспользованные реагенты допускается хранить в плотно закрытых упаковках при температуре от 2 до 8 ^оС до истечения срока годности.

 

Проведение ИФА (“ручная” постановка)

Внимание! Соблюдение указанных ниже температуры и времени инкубации планшетов на каждой стадии постановки крайне важно для получения достоверных результатов.

1. Извлечь из упаковки рамку планшета и необходимое число стрипов. Неиспользованные стрипы допускается хранить в плотно закрытом пакете с влагопоглотителем при температуре от 2 до 8 ^оС до истечения срока годности.
2. В лунку А1 внести 100 мкл РРО, в следующие лунки внести по 100 мкл контрольных образцов (по 2 лунки на образец), оставшиеся лунки использовать для исследуемых образцов (по 1 лунке на образец), для чего внести в них: вначале по 90 мкл РРО, а затем – по 10 мкл образцов, предварительно разведенных 1:10 в лунках вспомогательного планшета (см. раздел «Предварительное разведение исследуемых образцов»), тщательно перемешать пипетированием.
3. Инкубировать 30 мин при температуре 21-25 ^оС в защищенном от света месте.
4. С помощью промывателя удалить образцы из лунок, 4 раза промыть планшет промывочным раствором, внося в лунки 350-370 мкл раствора. При наличии промывателя, позволяющего производить промывку в режиме “Overflow”, использовать именно этот режим.
5. Во все лунки внести по 100 мкл конъюгата.
6. Инкубировать 30 мин при температуре 21-25 ^оС в защищенном от света месте.
7. С помощью промывателя удалить жидкость из лунок, 4 раза промыть планшет как указано в п. 4.
8. Во все лунки внести по 100 мкл раствора индикаторного, немедленно поместить планшет в защищенное от света место и выдержать 10 мин при температуре от 21 до 25 ^оС.
9. Во все лунки (в той же последовательности, с которой вносился индикаторный раствор) внести по 100 мкл стоп-реагента, осторожно (постукиванием по планшету) перемешать содержимое лунок и не более чем через 10-15 мин приступить к учету результатов.

Регистрация и учет результатов

Результаты ИФА регистрировать спектрофотометрически, выводя спектрофотометр на нулевой уровень (“бланк”) по лунке А1 и измеряя оптическую плотность (ОП) при двух длинах волн – 450 нм и 620-650 нм. При отсутствии референс-фильтра на 620-650 нм оптическую плотность (ОП) измерять при длине волны 450 нм.

Результаты ИФА учитываются при следующих условиях:

среднее значение ОП(К⁺₁) не менее 0,20;

среднее значение ОП(К⁺₄) не менее 0,80;

среднее значение ОП(К⁺₂) больше среднего значения ОП(К⁺₁) и меньше ОП(К⁺₃);

среднее значение ОП(К⁺₃) больше среднего значения ОП(К⁺₂) и меньше среднего значения ОП(К⁺₄).

среднее значение ОП(К^–) – не более 0,10,

в противном случае исследование необходимо повторить.

Учет результатов качественного определения

Рассчитывается пороговое значение ОП (ОП_пор) как среднее значение ОП(К⁺₁).

Исследуемые образцы учитывать как положительные при ОП_обр>1,1 ОП_пор.

Исследуемые образцы учитывать как отрицательные  при ОП_обр<0,9 ОП_пор.

Исследуемые образцы учитывать как сомнительные при 1,1 ОП_пор.≥ОП_обр≥0,9 ОП_пор.

Образцы, оцененные как сомнительные, должны быть исследованы повторно. При повторном получении сомнительных результатов рекомендуется мониторинг иммунного статуса пациента для исключения неспецифических, в том числе перекрестных реакций, приводящих к сомнительным результатам.

Учет результатов количественного определения

Для количественного учета результатов (содержание иммуноглобулинов класса G в исследуемых сыворотках в МЕ/мл) построить калибровочный график, для чего на стандартном бланке (вкладывается в каждый набор) по оси абсцисс (логарифмическая шкала) отложить содержание антител в К⁺₁, К⁺₂, К⁺₃ и К⁺₄ (в МЕ/мл), по оси ординат (пропорциональная шкала) – соответствующие им средние значения ОП, полученные в ИФА. Через полученные точки провести прямую линию.

Для каждого исследованного образца найти на калибровочном графике точку, ордината которой равна значению ОП, полученному в ИФА с этим образцом; абсцисса этой точки будет равна содержанию в разведенном образце иммуноглобулинов класса G в МЕ/мл.

Если концентрация IgG выше 10 МЕ/мл, образец считается положительным. При обследовании беременных в качестве защитного титра, защищающего от реинфекции, рекомендован уровень 30 МЕ/мл.

Если значение ОП испытуемой сыворотки превышает значение ОП(К⁺₄), ее необходимо исследовать повторно в большем разведении.

Рекомендуемые разведения сыворотки:

при значениях ОП до 2,0 – 1:200;

при значениях ОП выше 2,0 – 1:400.

Диагностическая значимость и интерпретация результатов

Результаты серологического исследования могут быть использованы для постановки окончательного диагноза только с учетом данных анамнеза и клинической картины. Выявление IgG антител при качественном исследовании требует обязательной оценки их содержания (в МЕ/мл) и последующего наблюдения его динамики, поскольку только постоянство, нарастание или снижение этого показателя во времени может быть поставлено в соответствие с анамнезом и клинической картиной:

IgG	IgM	Интерпретация	Рекомендации
–	–	специфические антитела не обнаружены	при подозрении на острую инфекцию рекомендуется контрольное исследование, при беременности – повторная проверка во втором и третьем триместрах
–	+	возможна начальная фаза инфекции или недавняя инфекция, возможна также реинфекция или латентная инфекция	мониторинг IgM- и IgG-антител в течение 10-14 суток для определения сероконверсии; подтверждающие тесты, нпр. РИФ, иммуноблоттинг, определение IgА-антител и авидности IgG-антител к Toxoplasma gondii
+	–	возможна инфекция в прошлом, вероятен конгенитальный токсоплазмоз или реинфекция	при подозрении на острую инфекцию – мониторинг IgG- и IgM-антител для определения динамики их содержания;  подтверждающие тесты, нпр. РИФ, иммуноблоттинг, определение IgА-антител и авидности IgG-антител к Toxoplasma gondii
+	+	возможна начальная фаза инфекции или недавняя инфекция, возможна также реинфекция или латентная инфекция	мониторинг IgM- и IgG-антител в течение 10-14 суток для определения сероконверсии; подтверждающие тесты, нпр. РИФ, иммуноблоттинг, определение IgА-антител и авидности IgG-антител к Toxoplasma gondii

ПОСТАНОВКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИФА-АНАЛИЗАТОРОВ

Подготовить прибор в соответствии с инструкцией по его эксплуатации, ввести программу анализа, соответствующую используемому набору, и провести анализ.

СРОК ГОДНОСТИ

Срок годности набора – 1 год. Набор с истекшим сроком годности применению не подлежит.

ХРАНЕНИЕ И ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ

Хранение

В упаковке предприятия-изготовителя при температуре от 2 до 8 ^оС. Замораживание не допускается.

Транспортирование

При температуре от 2 до 8 ^оС. Замораживание не допускается. Допускается транспортирование при температуре от 9 до 25 ^оС в течение 10 сут.

УСЛОВИЯ ОТПУСКА

Для учреждений здравоохранения.

По вопросам, касающимся качества набора «ИФА-Токсо-IgG», следует обращаться по адресу 142530 Московская обл., г. Электрогорск, ул. Буденного, д. 1, ЗАО “ЭКОлаб”; тел. (49643) 3-23-11, факс (49643) 3-30-93 – отдел сбыта, (49643) 3-37-30 – ОБТК  и в учреждение, уполномоченное Росздравнадзором на проведение государственного контроля качества указанной продукции.

 

 

 

 

КРАТКАЯ СХЕМА ПОСТАНОВКИ ИФА

(ИФА-Токсо-IgG)

Использовать только после тщательного ознакомления с инструкцией!
Внести	в лунку А1– 100 мкл РРО, в лунки B1, С1- по 100 мкл К+1, в лунки D1, E1-по 100 мкл К+2, в лунки F1,G1 –по 100 мкл К+3, в лунки H1,A2 – по 100 мкл К+4, в лунки В2,С2 – по 100 мкл К–, в следующие лунки –по 100 мкл подготовленных исследуемых образцов (по 1 лунке на образец)
Инкубация	30 мин, 21-25 оС
Промыть	4 раза промывочным раствором
Внести	по 100 мкл конъюгата в каждую лунку
Инкубация	30 мин, 21-25 оС
Промыть	4 раза промывочным раствором
Внести	по 100 мкл индикаторного раствора в каждую лунку
Инкубация	10 мин, 21-25 оС
Внести	по 100 мкл стоп-реагента в каждую лунку
Измерить	ОП при 450 нм (референс 620-630 нм), «бланк» – по лунке А1

Июль 2014 г.

[1] Взамен инструкции, утвержденной 24.12.2004 г., № 01-11/90-04.

Скачать Инструкцию 

Скачать РУ

Домой

ИФА-Токсо-IgG