ИФА-Хеликобактер-IgA. № ФСР 2010/08509 от 03.08.2010
Тест-система иммуноферментная для выявления иммуноглобулинов класса А к Helicobacter pylori
ИНСТРУКЦИЯ по применению набора реагентов “ИФА-Хеликобактер IgA”
Тест-система иммуноферментная для выявления иммуноглобулинов класса А к Helicobacter pylori
Регистрационное удостоверение №ФСР 2010/08509 от “03” августа 2010 г.
НАЗНАЧЕНИЕ
Выявление и определение титра видоспецифических иммуноглобулинов класса А к Helicobacter pylori в сыворотке (плазме) крови людей методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) при “ручной” постановке и с использованием ИФА-анализаторов.
СОСТАВ И КОМПЛЕКТАЦИЯ НАБОРА
| Иммуносорбент | лизатный инактивированный очищенный антиген Helicobacter pylori, сорбированный на 96-луночном разборном полистироловом планшете для иммунологических реакций с плоским дном (используются “ломающиеся” стрипы) | 1 планшет |
| допускается раздельная упаковка стрипов (по 1-4 стрипа в пакете) | ||
| Контрольный положительный образец (К+) | инактивированный, содержит антитела класса А к Helicobacter pylori в титре 1:400; прозрачная жидкость красного цвета | 1 фл.
(1,2 мл) |
| Контрольный образец уровня среза (К+пор) | инактивированный; содержит антитела к Helicobacter pylori в “пороговом” титре (1:100); прозрачная жидкость желтого цвета | 1 фл.
(1,2 мл) |
| Контрольный отрицательный образец (К–) | инактивированный; прозрачная жидкость зеленого цвета | 1 фл.
(1,2 мл) |
| Конъюгат | антитела овечьи против иммуноглобулинов человека класса А, меченые пероксидазой; жидкость розового цвета | 1 фл.
(13 мл) |
| Раствор для разведения образцов (РРО) | прозрачная жидкость синего цвета | 1 фл.
(100 мл) или 2 фл. (по 50 мл) |
| 25-кратный концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином [ФСБ-Т(х25)] | слегка опалесцирующая бесцветная пенящаяся жидкость, возможно выпадение осадка солей белого цвета, растворяющегося при температуре 37 0С в течение 30 мин.
|
1 фл.
(80 мл) или 2 фл. (по 40 мл) |
| Раствор индикаторный (РИ); | прозрачная бесцветная жидкость
|
1 фл.
(13 мл) |
| Стоп-реагент | прозрачная бесцветная жидкость | 1 фл.
(12,5 мл) |
Примечания. 1. Набор включает все реагенты, необходимые для постановки ИФА, кроме очищенной (дистиллированной или деионизированной) воды.
- ФСБ-Т(х25), РИ, РРО, стоп-реагент – унифицированы для всех наборов ЗАО “ЭКОлаб”, в которых используются указанные реагенты.
Набор может быть дополнительно укомплектован:
вспомогательными пластиковыми емкостями (4 шт.),
планшетом для предварительного разведения образцов (1 шт.),
одноразовыми наконечниками для автоматических пипеток (16 шт.),
клейкой пленкой для планшетов (4 шт.).
Компоненты набора упакованы в коробку, в коробку вложена инструкция по применению и бланк калибровочного графика.
По желанию потребителя базовая комплектация набора (число индивидуальных упаковок с реагентами и их объемы) может быть изменена
ОСНОВНЫЕ ПОТРЕБИТЕЛЬСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Базовый вариант комплектации позволяет одномоментное исследование 96 образцов, включая контрольные (на контрольные образцы используется 6 лунок, одна лунка используется для контроля уровня “бланк”). Предусмотрена возможность проведения раздельных исследований с использованием необходимого количества стрипов:
| Число стрипов | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| Число иссл. образцов | 1 | 1-9 | 10-17 | 18-25 | 26-33 | 34-41 | 42-49 | 50-57 | 58-65 | 66-73 | 74-81 | 82-89 |
ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ
При наличии в исследуемом образце антител класса А к Helicobacter pylori, они связываются с антигеном, сорбированным на поверхности лунок полистиролового планшета; этот комплекс, в свою очередь, связывается с конъюгатом – антителами против IgA человека, мечеными пероксидазой хрена. Образовавшийся комплекс “антиген-антитело-конъюгат” выявляется в реакции с индикаторным раствором, содержащим хромоген – тетраметилбензидин, в результате которой меняется цвет (оптическая плотность) реакционной смеси в лунке планшета; изменение регистрируется спектрофотометрически.
АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА
Аналитическая чувствительность (минимальный определяемый титр иммуноглобулинов класса А к Helicobacter pylori) – не более 1:45.
Коэффициент вариации ОП контрольных образцов – не более 8 %.
ИССЛЕДУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ
Нативная сыворотка (плазма) крови человека объемом не менее 100 мкл.
Образцы сыворотки (плазмы) крови до исследования можно хранить не более 7 сут при температуре от 2 до 8 оС и 3 мес при температуре минус 20 оС или более низкой. Допускается только однократное замораживание-размораживание образцов. Размороженные образцы перед исследованием тщательно перемешать.
Не допускается использование для исследования образцов с повышенным содержанием липидов и (или) с признаками гемолиза, и (или) с видимым микробным проростом.
Образцы, содержащие осадок, перед анализом отцентрифугировать в течение 10-15 мин при 2500-3000 об/мин.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Набор биологически безопасен, однако с исследуемыми образцами необходимо обращаться как с потенциально инфицированным материалом.
Стоп-реагент при попадании на незащищенную кожу и слизистые может вызывать химические ожоги. В случае попадания на кожу – немедленно промойте пораженный участок водой.
СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ
Оборудование и материалы (для “ручной” постановки)
Дозаторы пипеточные (пипетки полуавтоматические одно- и многоканальные переменного объема) для внесения реагентов в лунки планшета с погрешностью дозирования не более 5 % с наконечниками полипропиленовыми одноразовыми.
Ручные, или автоматические промыватели, или восьми- и двенадцатиканальные пипеточные дозаторы для промывания лунок планшета.
Спектрофотометр вертикального сканирования для измерения оптической плотности в лунках планшета при 450 нм и/или в двухволновом режиме при основной длине волны 450 нм и длине волны сравнения в диапазоне 620-650 нм.
Центрифуга лабораторная на 2,5-3,0 тыс. об/мин, термостат на 37 оС, холодильник бытовой, фильтровальная бумага.
Вода очищенная (дистиллированная или деионизированная).
70 %-ный раствор спирта этилового и 6 %-ный раствор перекиси водорода (дез.растворы) или растворы иных дезинфектантов, разрешенных к применению СП 1.32322-08, кроме хлорсодержащих.
Приготовление рабочих растворов реагентов для ИФА
Перед работой извлечь набор из холодильника, вскрыть упаковку и выдержать все реагенты перед проведением анализа не менее 30 мин при температуре от 18 до 25 оС.
Подготовка исследуемых образцов.
Возможны два способа приготовления рабочих разведений:
1 способ
По 10 мкл каждого образца смешать с 1 мл РРО (разведение 1:100), тщательно перемешать пипетированием.
2 способ
Образцы вначале развести 1:10 во вспомогательном планшете, для чего внести в его лунки по 90 мкл РРО, затем внести в них по 10 мкл исследуемых образцов, тщательно перемешать пипетированием. Рабочее разведение (1:100) готовить непосредственно в лунках иммуносорбента (см. раздел Проведение ИФА (“ручная” постановка), п. 2)
Рабочие разведения образцов хранить не более 6 ч при температуре от 18 до
25 оС.
Приготовление рабочего промывочного раствора (ФСБ-Т)
При выпадении осадка солей в ФСБ-Т(х25) прогреть его при температуре 37 оС до полного растворения осадка.
При постановках с использованием ИФА-анализаторов 80 мл ФСБ-Т(х25) довести водой очищенной до 2 л.
При дробной “ручной” постановке использовать соотношения объемов ФСБ-Т(х25) и воды, указанные в табл. 1 для разного числа используемых стрипов.
Таблица 1
| Реагент | Объем реагента, мл, на …..стрипов | |||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| ФСБ-Т(х25) | 3 | 7 | 10 | 13 | 17 | 20 | 23 | 27 | 30 | 33 | 37 | 40 |
| Вода очищенная | до 75 | до 175 | до 250 | до 325 | до 425 | до 500 | до 575 | до 675 | до 750 | до 825 | до 925 | до 1000 |
Готовый рабочий промывочный раствор хранить при температуре от 2 до 8 ºС не более 14 сут.
Приготовление остальных реагентов
Иммуносорбент, контрольные образцы, РРО, конъюгат, РИ, стоп-реагент – готовы к применению.
После вскрытия упаковок неиспользованные реагенты допускается хранить в плотно закрытых упаковках при температуре от 2 до 8 оС до истечения срока годности
Проведение ИФА
Внимание! Соблюдение указанных ниже температуры и времени инкубации планшетов на каждой стадии постановки крайне важно для получения достоверных результатов.
- Извлечь из упаковки рамку планшета и необходимое число стрипов. Неиспользованные стрипы допускается хранить в плотно закрытом пакете с влагопоглотителем при температуре от 2 до 8 оС до истечения срока годности.
- В лунку А1 внести 100 мкл РРО, в следующие лунки внести по 100 мкл контрольных образцов (по 2 лунки на образец), оставшиеся лунки использовать для исследуемых образцов (по 1 лунке на образец), для чего внести в них:
при первом способе приготовления рабочих разведений исследуемых образцов – по 100 мкл готовых разведений;
при втором способе приготовления рабочих разведений исследуемых образцов – вначале по 90 мкл РРО, а затем – по 10 мкл образцов, предварительно разведенных 1:10 в лунках вспомогательного планшета, тщательно перемешать пипетированием.
- Планшет закрыть крышкой или клейкой пленкой. Инкубировать 30 мин при температуре от 21 до 25 оС в защищенном от света месте.
- С помощью промывателя удалить образцы из лунок, 4 раза промыть планшет промывочным раствором, внося в лунки 350-370 мкл раствора. При наличии промывателя, позволяющего производить промывку в режиме “Overflow”, использовать именно этот режим. По окончании промывки остатки раствора удалить из лунок, постукивая перевернутым планшетом по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге
- Во все лунки внести по 100 мкл конъюгата. Планшет закрыть крышкой или клейкой пленкой. Инкубировать 30 мин при температуре от 21 до 25 оС в защищенном от света месте.
- С помощью промывателя удалить жидкость из лунок, 4 раза промыть планшет, как указано выше.
- Во все лунки внести по 100 мкл раствора индикаторного, немедленно поместить планшет в защищенное от света место и инкубировать 10 мин при температуре от 21 до 25оС.
- Во все лунки (в той же последовательности, с которой вносился субстратно-индикаторный раствор) внести по 100 мкл стоп-реагента, осторожно (постукиванием по планшету) перемешать содержимое лунок и не более чем через 10 мин приступить к учету результатов.
Регистрация и учет результатов
Результаты ИФА регистрировать спектрофотометрически, выводя спектрофотометр на нулевой уровень (“бланк”) по лунке А1 и измеряя оптическую плотность (ОП) при двух длинах волн – 450 нм и 620-650 нм. При отсутствии референс-фильтра на 620-650 нм оптическую плотность (ОП) измерять при длине волны 450 нм.
Результаты ИФА учитываются только при следующих условиях:
ОПбланк – не более 0,1;
среднее значение ОП(К+) – не менее 0,6;
среднее значение ОП(К+пор) – не менее 0,25;
среднее значение ОП(К–) – не более 0,15,
отношение среднего значения ОП(К+) к среднему значению ОП(К+пор) – не менее 1,5; в противном случае исследование необходимо повторить.
Учет результатов качественного определения
Исследуемые образцы учитывать как положительные при ОПобр больше
1,1× ОП(К+пор).
Исследуемые образцы учитывать как отрицательные при ОПобр меньше
0,9 ×ОП(К+пор)
Исследуемые образцы учитывать как сомнительные при ОПобр в диапазоне от
0,9× ОП(К+пор) до 1,1× ОП(К+пор).
Образцы, оцененные как сомнительные, должны быть исследованы повторно. При повторном получении сомнительных результатов рекомендуется мониторинг иммунного статуса пациента для исключения неспецифических, в том числе перекрестных реакций, приводящих к сомнительным результатам.
Учет результатов полуколичественного определения
Для полуколичественного учета результатов (титр антител класса А к Нelicobacter pylori в исследуемых образцах) построить калибровочную кривую, для чего на стандартном бланке (вкладывается в каждый набор) по оси абсцисс (логарифмическая шкала) отложить значения титров К+ и К+пор, указанные в разделе “Состав набора”, а по оси ординат (пропорциональная шкала) – соответствующие им средние значения ОП, полученные в ИФА. По полученным точкам провести прямую линию.
Для оценки титра исследуемого образца на калибровочной кривой найти точку, ордината которой равна значению ОП, полученному в ИФА с этим образцом; абсцисса этой точки будет равна титру антител класса G в образце.
Если значение ОП испытуемого образца превышает значения ОП(К+), его следует протестировать повторно в большем разведении.
ПОСТАНОВКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИФА-АНАЛИЗАТОРОВ
Подготовить прибор в соответствии с инструкцией по его эксплуатации, ввести программу анализа, соответствующую используемому набору, и провести анализ.
Диагностическая значимость и интерпретация результатов
Результаты серологического исследования могут быть использованы для постановки окончательного диагноза только с учетом данных анамнеза и клинической картины. Выявление IgА антител при качественном исследовании требует обязательной оценки их титра и последующего наблюдения его динамики, поскольку только постоянство, нарастание или снижение этого показателя во времени может быть поставлено в соответствие с анамнезом и клинической картиной.
| IgG | IgА | Интерпретация | Рекомендации |
| – | – | специфические антитела не обнаружены | при подозрении на острую инфекцию рекомендуется контрольное исследование |
| + | + | возможна острая или предшествующая инфекция; при наличии клинических проявлений предусматривается лечение | мониторинг IgG- и IgА-антител для определения динамики их титра; использование других методов диагностики, нпр. гистологическое исследование |
| + | – | возможно образование только IgG-антител или эндемический инфекционный титр; при наличии клинических проявлений предусматривается лечение | мониторинг IgG- и IgА-антител для определения динамики их титра; использование других методов диагностики, нпр. гистологическое исследование |
| – | + | возможно образование только IgА-антител; при наличии клинических проявлений предусматривается лечение | мониторинг IgG- и IgА-антител для определения динамики их титра; использование других методов диагностики, нпр. гистологическое исследование |
СРОК ГОДНОСТИ
Срок годности набора – 1 год. Набор с истекшим сроком годности применению не подлежит.
ХРАНЕНИЕ И ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ
Хранение
В упаковке предприятия-изготовителя при температуре от 2 до 8 оС. Замораживание не допускается.
Транспортирование
При температуре от 2 до 8 оС. Замораживание не допускается. Допускается транспортирование при температуре от 9 до 25 оС в течение 10 сут.
УСЛОВИЯ ОТПУСКА
Для учреждений здравоохранения.
По вопросам, касающимся качества набора, следует обращаться по адресу 142530 Московская обл., г. Электрогорск, ул. Буденного, д. 1, ЗАО “ЭКОлаб”; тел. (49643) 3-23-11, факс (49643) 3-30-93 – отдел сбыта, (49643) 3-37-30 – ОБТК и в учреждение, уполномоченное Росздравнадзором на проведение государственного контроля качества указанной продукции.
КРАТКАЯ СХЕМА ПОСТАНОВКИ ИФА
“ИФА-Хеликобактер-IgА”
| Использовать только после тщательного ознакомления с инструкцией! | |
| Внести | в лунку А1 – 100 мкл РРО;
в лунки B1, C1 – по 100 мкл К+, в лунки D1, E1 – по 100 мкл К+пор, в лунки F1, G1 – по 100 мкл К–, в следующие лунки – по 100 мкл подготовленных исследуемых образцов (по 1 лунке на образец) |
| Инкубация | 30 мин, 21-25 оС |
| Промыть | 4 раза промывочным раствором |
| Внести | по 100 мкл конъюгата в каждую лунку |
| Инкубация | 30 мин, 21-25 оС |
| Промыть | 4 раза промывочным раствором |
| Внести | по 100 мкл индикаторного раствора в каждую лунку |
| Инкубация | 10 – 15 мин, 21-25 оС |
| Внести | по 100 мкл стоп-реагента в каждую лунку |
| Измерить | ОП при 450 нм (референс 620-650 нм), «бланк» – по лунке А1 |
